目前，支原体有超过200多个物种，是哺乳动物细胞培养中的常见污染菌。有研究表明，5%-35%的细胞培养中均存在支原体污染，甚至有的可高达70%[2,3]。支原体污染可以对核酸、蛋白和细胞等产生深远而负面的影响，如改变核酸合成，影响细胞信号通路传导，改变细胞膜结构，影响细胞活力等[2]。细胞培养作为生物医学研究和生物制药（如抗体生产）的重要环节或生产原料，为确保其应用的准确性和良好质量状态，对细胞或其培养产物进行支原体检测是十分必要的，也是多国药典中所要求的检测项目。

目前检测支原体污染的方法包括分离培养法、PCR法、DNA染色法、酶法、ELISA方法等[4,5]，其各有优缺点，如表1.

表1 支原体检测常见方法发简述

由于没有一种方法可以同时兼顾速度、特异性和成本，所以通常研究者会根据实验需求，选择不同的组合对支原体进行检测和鉴定。而快速检测即为最初，也是最为重要的一个筛选步骤，根据快检的结果，研究者进而再使用其他特异性更好的方法进行鉴定或分离。目前速度最快的方法是酶法（化学发光法），检测时间＜20分钟。基本原理为支原体特异性酶催化底物反应，将ADT转化为ATP，荧光素酶在有ATP存在的条件下，催化荧光素发出光，通过检测光信号来判断是否有支原体的污染，如下：

目前已经有商品化的试剂盒可以使用，如MycoAlert PLUS Mycoplasma Detection Kit（LONZA），TransDetect? Luciferase Mycoplasma Detection Kit（TransGen Biotech）。其中MycoAlert PLUS Mycoplasma Detection Kit（LONZA）可以检测大约180种支原体，本文以该试剂盒为例，探讨在Tecan Spark 多功能微孔板检测仪上实现支原体的快速、简单检测。

1 实验设计

采用自制支原体样本，进行2倍梯度稀释，合计7个梯度，并准备8个细胞培养上清样本进行实验，检测细胞样本是否有支原体污染，所有样本做两个复孔。

2 试剂和仪器

MycoAlert PLUS Mycoplasma Detection Kit（LONZA），96孔白板（Costar），支原体样本（自制），待测细胞培养上清样本（自制）；Spark多功能微孔板检测器（含注射器）；移液器，枪头等。

3 实验步骤与结果判读（如下）

根据试剂盒说明准备试剂和样本

96孔板中加入样本100ul；自动注射器加入MycaAler试剂100ul；混匀、室温静置5分钟，读发光值，设为A值

自动注射器加入MycaAlert Substrate试剂100ul；混匀、室温静置10分钟，读发光值，设为B值

计算B/A比值（ratio）

ratio1<1，阳性

ratio1-1.2，可疑

（继续培养24hr再测）

ratio>1.2，阳性

4 微孔板检测仪工作流程

5 结果

支原体样本和待测细胞上清样本的发光测定数值和结果如下：

5.1 支原体样本

5.2 细胞培养上清样本

由上表可知，支原体样本在7个梯度稀释下，均呈现出B/A ratio＞1.2，即理论和实际检测的结果相符。而细胞培养上清样本的B/A ration均小于1，即待测样本无支原体污染。

6 结论

采用Spark 多功能为孔板间检测器，配合使用目前市面上提供的酶法支原体检测试剂盒，可以实现半自动化的实验过程，即只需要准备试剂和加入待测样本，后续均可以由仪器完成试剂加入、混匀、检测等步骤，无需人工干预。配合使用Magellan软件，可以对结果进行分析并直接给出测试结果和报告。整个测试的过程＜20分钟，是细胞培养过程中，支原体污染检测的强有力工具。

Tecan Spark多功能微孔板检测仪（酶标仪）是目前市面上最为高端的酶标仪之一，包含了多个检测和辅助模块，如吸光度检测，荧光检测，发光检测，二氧化碳培养箱功能，自动开盖与双自动注射器，明场成像等。各模块可以独立或联合使用，其超低杂光率（＜10-6）的高速光栅（HSM）更是一绝，200-1000nm全波长扫描耗时＜5秒，加上融合光路设计、各模块专用检测器等配置，使得仪器不仅有稳定的检测性能，＞10年的使用寿命，还具有极其广泛的应用范围，是目前不可多见的研究工具之一。