核酸定量一直是分子生物学中的基础实验，几乎任何一 种生物学现象都涉及对核酸浓度的定量工作。对于核酸定量而言，根据其检测精度可分为相对定量和绝对定量，前者以OD260\OD280的检测为主，而后者则类似于实时定 量PCR中的使用特定荧光探针实现核酸的精确定量。OD260的检测原理是DNA在260nm波长处有最佳的吸光效果，而对于日常的核酸OD260检测而言，更多的人习惯于超微量260nm检测，这种方法的原理并无差异，其最大的优势在于将常规核酸定量的样品体积从200ul-1ml降低至不足2ul。早期的核酸荧光定量方法中，Hochest33258的检测极限可以低至10ng/mL[1]，而Quant-iT? PicoGreen对于dsDNA的检测灵敏度与前者相比至少提高了400倍[2]。

本文旨在向大家介绍Infinite200pro系列酶标仪在核酸定量中的使用方法和检测效果，希望能够对实验人员的核酸定 量工作有所帮助。

Infinite200pro?（M-Plex）是Tecan最新推出的多功能酶标 仪，由光吸收、荧光和化学发光模块组成。其采用四光栅设计理念，波长覆盖230-1000nm，能够确保无论光吸收还是荧光实验都能够得到最佳的波长选择精度。化学发光模块为多色发光实验配备了最新的滤光片组，确保仪器能够胜任包括单色、双色、多色发光在内的所有化学发光实验。

NanoQuant-Plate是Tecan专为核酸超微量（2ul）检测所 打造的检测板。该检测板采用热压技术，将石英光路永久镶用于微量核酸定量嵌在金属材料中，这样设计的好处是避免了可拆卸设计造成的反复人工校准。

NanoQuant一次可以完成16个核酸样品的检测工作。内置的分析软件能够一次性给出OD260、260/ 280和核酸浓度数据，无需人工计算。NanoQuant板的清洗也简单快捷，使用无絮纸对石英光路的上下两个支持面进行擦拭即可。

材料和方法

Infinite 200pro F-Plus 多功能酶标仪

Infinite200pro M-Plex多功能酶标仪

96-well UV-Star?, flat bottom, Black microplates (Greiner Bio-One, Austria)

Tris-EDTA (TE) buffer (BioThema, Sweden)

Phage Lambda-DNA, 100 μg/ml (Invitrogen, USA)

70 % ethanol

ddH2O

Quant-iT? PicoGreen检测试剂盒

RiboGreen RNA检测试剂盒

试剂准备

Nanoquant超微量核酸定量

使用ddH2O将1x TE中的λ-DNA稀释为5、10、20、50μg/ ml

Quant-iT? PicoGreen

使用ddH2O将20xTE缓冲液稀释至1xTE。1xTE缓冲液用于稀释Quant-iT? PicoGreen试剂，以及lambda-DNA检测。使用1xTE缓冲液将Quant-iT? PicoGreen试剂稀释200倍，并在室温下避光保存。

RiboGreen RNA

全程使用ddH2O进行稀释，实验过程中注意对手套及其他塑料制品进行清洁，以确保消除RNA水解酶对样品的影响。将20×TE稀释至1×TE，分别将RiboGreen试剂稀释200倍和2000倍。

实验操作

核酸样品的荧光定量方法

根据下表对噬菌体λ-DNA进行稀释（见表1），稀释完成后将各浓度样品取出100ul，并各自在含有100ul PicoGreen试剂的微孔中进行3个复孔的混合，避光孵育5分钟后进行测试。

对于1ng/ml -1ug/ml的RNA样品进行不同的稀释处理（见表2），深绿色为高浓度的RNA样品（使用200倍稀释的RiboGreen试剂进行混合），浅绿色为低浓度RNA样品（使用2000倍稀释的RiboGreen试剂进行混合），按照100ul RNA样品与100ul RiboGreen试剂的比例进行混合，最终获得如表2所示的最终浓度。

测量参数

Nanoquant超微量核酸定量

将5、10、20和50μg/ml的DNA样品，取2ul点加在Nanoquant板的石英平台上，每个样品进行16个平行样品检测，以表3中的参数进行测试，注意M-Plex与F-Plus在进行核酸OD260检测时，参比波长各自为340nm和310nm。

PicoGreen与RiboGreen的参数设定

分别使用F-Plus和M-Plex对DNA和RNA样品测试，DNA和RNA的测试条件一致，详细设置请见下表

结果

Nanoquant超微量核酸定量及纯度

PicoGreen定量结果

RiboGreen定量结果

讨论

OD260是常规的核酸相对定量方法，广泛的应用于各个级别的生化分子实验室。Tecan的Nanoquant微量板是专为OD260的超微量检测所定制，其最大的优势在于强大的加工工艺使得石英光路与金属材料一次压制成型，这保证了其间不存在任何缝隙，因此使得Nanoquant无需手动校准即可保持超高的检测稳定性。表5是扣除空白后的平均值，结果显示。DNA样品的260/280跟预期一致。检测均一性良好，16个复孔的CV%在1.44到8.67之间。在该应用中，DNA的理论检测限为1μg/ml。

虽然OD260方法很常见，但由于其检测精度有限，在诸如文库构建等高准确性要求的实验中很难令人满意。基于荧光探针的PicoGreen和RiboGreen是目前市场上成熟的DNA和RNA的准确定量方法，其核心在于荧光染料能够嵌入核酸结构中，荧光强度与核酸浓度成正比，再根据标准核酸样品所绘制的标准曲线进行核酸样品的定量计算。根据Invitrogen的说明，PicoGreen的检测限为25pg/200ul，而使用M-Plex（光栅型）和F-Plus（滤光片型）多功能酶标仪均可以检测到20pg/200ul的浓度，这充分说明这两款酶标仪出类拔萃的检测能力；RiboGreen的检测范围是1ng/mL-1000ng/mL，而使用F-Plus和M-Plex酶标仪所计算得到的检测范围分别在150pg/mL-1ug/mL以及200pg/mL-1ug/mL之间，说明无论F-Plus还是M-Plex均能够完全发挥试剂盒的功能。

结论

Tecan旗下的F-Plus和M-Plex是Infinite200pro系列的分支，两款设备的区别在于不同的分光方式，前置采用滤光片选择波长，而后者则以光栅为主。此两款设备均可以完全胜任核酸样品的检测工作，无论是简单的OD260定量还是复杂的PicoGreen及RiboGreen方法。此外，两者均可与Nanoquant超微量板进行联用，为实验人员在进行核酸定量中带来更多的便捷。